基于PAM-free LAMP-CRISPR/Cas12a (Cas-PfLAMP)的水稻病原體快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)平臺(tái)
水稻細(xì)菌性、真菌性和病毒性疾病嚴(yán)重威脅糧食生產(chǎn)與安全。現(xiàn)有檢測(cè)方法（如傳統(tǒng)培養(yǎng)、qPCR、免疫學(xué)方法等）存在依賴專業(yè)設(shè)備、耗時(shí)、成本高或存在交叉反應(yīng)等缺陷，無法滿足田間即時(shí)檢測(cè)（POCT）的需求。
上海交通大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種無需PAM序列限制的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增偶聯(lián)CRISPR/Cas12a檢測(cè)新方法（Cas-PfLAMP），并結(jié)合側(cè)流層析試紙條，用于水稻白葉枯病菌、水稻條紋病毒和水稻黑條矮縮病毒的快速、高靈敏、高特異且現(xiàn)場(chǎng)可視化診斷。
核心技術(shù)：Cas-PfLAMP平臺(tái)
PAM-free LAMP擴(kuò)增：為避免CRISPR/Cas12a系統(tǒng)對(duì)PAM序列（如TTTN）的嚴(yán)格依賴，本研究在LAMP引物（FIP）的F2與F1c連接區(qū)（Linker region）預(yù)插入了一個(gè)TTTT PAM序列，使得擴(kuò)增產(chǎn)物天然包含可被Cas12a識(shí)別的PAM位點(diǎn)。這種“PAM-free”設(shè)計(jì)極大地提升了方法的通用性和靈活性。
CRISPR-Cas12a檢測(cè)：利用設(shè)計(jì)好的特異性單鏈向?qū)NA引導(dǎo)FnCas12a蛋白識(shí)別并切割含PAM位點(diǎn)的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物。此過程激活Cas12a的反式切割（trans cleavage）活性，無差別切割反應(yīng)體系中的單鏈DNA熒光報(bào)告探針。
結(jié)果判讀：開發(fā)了熒光實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和側(cè)流層析試紙條（LFS） 兩種可視化方案。
熒光法：使用FAM-淬滅基團(tuán)標(biāo)記的報(bào)告探針，陽(yáng)性結(jié)果釋放熒光。
試紙條法（LFS）：使用FAM-生物素雙標(biāo)記的報(bào)告探針，切割后產(chǎn)物在試紙條上顯示檢測(cè)線（T線），結(jié)果直觀可視，無需任何儀器。
其中，使用的LFS是來自沃博生物warbio的CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條,貨號(hào)JY0301。
“雙保險(xiǎn)”特異性：結(jié)合了LAMP引物（識(shí)別6個(gè)位點(diǎn)） 和CRISPR sgRNA特異性識(shí)別的雙重精準(zhǔn)識(shí)別機(jī)制，有效降低了傳統(tǒng)LAMP因非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致的假陽(yáng)性。
操作簡(jiǎn)便：全程恒溫反應(yīng)（LAMP：65°C；CRISPR/Cas12a切割：37°C），可使用便攜式設(shè)備（如智能保溫杯）加熱，非常適合田間操作。
快速核酸提取：配套使用商業(yè)化固相核酸提取試劑盒，無需研磨葉片，5分鐘內(nèi)即可完成大批量樣品處理。
使用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為校準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)試。
對(duì)于水稻白葉枯病菌（XOO），檢測(cè)限為9 拷貝/反應(yīng)。
對(duì)于水稻條紋病毒（RSV） 和水稻黑條矮縮病毒（RBSDV），檢測(cè)限均低至3 拷貝/反應(yīng)。當(dāng)結(jié)合試紙條（LFS）讀數(shù)時(shí)，靈敏度略降為9 拷貝/反應(yīng)。
靈敏度主要得益于LAMP的高效擴(kuò)增和Cas12a反式切割的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大。
對(duì)包括其他黃單胞菌屬細(xì)菌、多種水稻病毒在內(nèi)的總計(jì)25種相關(guān)病原菌/病毒菌株進(jìn)行交叉反應(yīng)測(cè)試。
結(jié)果顯示，三個(gè)Cas-PfLAMP檢測(cè)體系均無交叉反應(yīng)，特異性高達(dá)100%，僅對(duì)各自的目標(biāo)病原體產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)。
3.現(xiàn)場(chǎng)樣本驗(yàn)證：
從上海交通大學(xué)閔行校區(qū)水稻田中采集14份葉片樣本，利用集成了固相提取、便攜加熱和LFS試紙條的完整現(xiàn)場(chǎng)平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)。
操作全程僅需約60分鐘（樣品間并行處理）。檢測(cè)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)PCR/RT-PCR和LAMP驗(yàn)證結(jié)果完全一致，證明了該平臺(tái)在實(shí)際田間應(yīng)用中的可靠性和實(shí)用性。
本研究成功構(gòu)建了一個(gè)名為Cas-PfLAMP的檢測(cè)平臺(tái)。該平臺(tái)的核心創(chuàng)新點(diǎn)在于通過改造LAMP引物“預(yù)埋”PAM序列，突破了CRISPR檢測(cè)對(duì)靶標(biāo)序列天然PAM位點(diǎn)的依賴性。結(jié)合開發(fā)的全流程現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)平臺(tái)（提取→擴(kuò)增→試紙條判讀），該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)水稻重要病原體的快速（~50-60分鐘）、超靈敏（<10 拷貝）、高特異且無需專業(yè)設(shè)備的現(xiàn)場(chǎng)診斷。這一平臺(tái)不僅能有效應(yīng)用于水稻病害監(jiān)測(cè)，其“PAM-free”設(shè)計(jì)理念也可擴(kuò)展至其他動(dòng)植物病害及各類核酸即時(shí)檢測(cè)領(lǐng)域。
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貨號(hào)
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產(chǎn)品
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規(guī)格
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TABAS03KIT
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TwistAmp Basic Kit DNA擴(kuò)增試劑盒
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96T
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TAEXO02KIT
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TwistAmp exo 試劑盒
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96T
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B8201C1
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DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（DNA基礎(chǔ)型）
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48T
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B8202C3
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DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（DNA熒光型）
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48T
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B8203C5
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DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（DNA試紙條型）
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48T
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B8204C7
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RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（RNA基礎(chǔ)型）
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48T
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B8205C9
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RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（RNA熒光型）
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48T
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B8206C0
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RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（RNA試紙條型）
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48T
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JY0209
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雙靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l（彩虹型）
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50T
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JY0201
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單靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l（彩虹型）
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50T
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JY0307
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CRISPR單酶切及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)試紙條
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50T
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JY0301
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CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條
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50T
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JY0308
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CRISPR雙酶切檢測(cè)試紙條（變色龍）
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50T
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